激光共聚焦顯微鏡對(duì)于樣品的要求及制備方法因樣品類型的不同而有所差異。以下是對(duì)不同類型樣品的要求及制備方法的詳細(xì)介紹：

一、樣品要求

生物樣品

熒光表達(dá)：對(duì)于需要觀察熒光標(biāo)記的樣品，應(yīng)先在熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)是否正常，以確定是否有必要使用激光共聚焦顯微鏡。

蓋玻片厚度：蓋玻片的厚度要求≤0.17mm，以確保成像質(zhì)量。

激發(fā)/發(fā)射波長：明確樣品的激發(fā)波長和發(fā)射波長，以便選擇合適的激光器進(jìn)行成像。

掃描參數(shù)：對(duì)于需要重構(gòu)的樣品，應(yīng)明確掃描區(qū)域大小、位置以及Z步進(jìn)等參數(shù)，這些參數(shù)會(huì)影響測試時(shí)間。

樣品固定：共聚焦的標(biāo)本B須貼壁良好，不能懸浮起來。樣品需要在載玻片上固定好后送樣測試。

抗熒光淬滅劑：做顯微成像時(shí)，樣品需要加抗熒光淬滅劑，并固定蓋玻片。

材料樣品

樣品制備：主要測試偏材料的樣品，樣品應(yīng)提前制備好。

尺寸與顏色：拍出來*大面積為1.11×1.8mm到5×5mm范圍內(nèi)，顏色可調(diào)。樣品的尺寸沒有具體要求，但B須平整。

二、制備方法

組織切片樣品

組織采集與固定：

采用液氮冷凍法或多聚甲醛（PFA）固定法采集和固定組織。

液氮冷凍法：將新鮮組織放入液氮中保存。

多聚甲醛固定法：將組織塊置于4%PFA中進(jìn)行后固定，時(shí)間根據(jù)組織塊大小和致密程度調(diào)整。

冷凍包埋與切片：

使用冷凍切片機(jī)將組織切成5~15μm的切片。

冷凍方法包括氣體CO2冷凍包埋法、干冰冷凍包埋法、液氮冷凍法和直接冷凍法。

免疫熒光標(biāo)記：

將冷凍組織切片進(jìn)行免疫熒光抗體標(biāo)記。

使用熒光顯微鏡觀察標(biāo)記是否成功，然后移至激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行掃描成像。

細(xì)胞培養(yǎng)樣品

熒光表達(dá)載體的構(gòu)建與導(dǎo)入：

構(gòu)建綠色熒光融合蛋白表達(dá)載體，并將其導(dǎo)入到培養(yǎng)細(xì)胞中。

常用的轉(zhuǎn)染方法有磷酸鈣轉(zhuǎn)染法和脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法。

細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：

將培養(yǎng)的細(xì)胞鋪在含有玻璃片的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。

在轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，繼續(xù)培養(yǎng)1~2天，使GFP標(biāo)記的蛋白表達(dá)水平達(dá)到能被熒光顯微鏡檢測的水平。

免疫熒光染色：

使用預(yù)冷的PBS緩沖溶液洗滌細(xì)胞，去除殘留的培養(yǎng)液。

加入4%多聚甲醛（PFA）固定液進(jìn)行固定。

使用Triton X-100處理細(xì)胞，通透細(xì)胞膜。

在含有1%BSA的PBS溶液中孵育細(xì)胞，封閉細(xì)胞和玻璃片。

加入一抗和二抗進(jìn)行結(jié)合，并使用熒光標(biāo)記的染料進(jìn)行染色。

*后使用封片劑封片，準(zhǔn)備進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡觀察。

三、其他類型樣品的制備方法

菌液/污泥/污水類樣品：

離心得到菌體沉淀，根據(jù)需要進(jìn)行死活染色或ROS染色。

樣品需加冰袋泡沫盒4℃保存，不與冰袋直接接觸。

生物膜樣品：

樣品表面應(yīng)平整，標(biāo)出拍攝面。

加冰袋泡沫盒4℃保存，不與冰袋直接接觸。

若在爬片上培養(yǎng)生物膜，可將爬片粘于培養(yǎng)皿底部，充滿培養(yǎng)基后封口膜密封保存。

植物類樣品：

可進(jìn)行簡單冰切及刀切處理。

加冰袋泡沫盒4℃保存，不與冰袋直接接觸。

與細(xì)胞共培養(yǎng)的樣品：

根據(jù)樣品類型和與細(xì)胞的作用方式確定送樣量和制樣要求。

提供清楚激發(fā)/發(fā)射波長、拍攝類型（2D/3D）、拍攝倍數(shù)等要求。

綜上所述，激光共聚焦顯微鏡對(duì)于不同類型樣品的要求及制備方法有所不同。在制備樣品時(shí)，應(yīng)根據(jù)樣品的類型和實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的方法和步驟進(jìn)行操作。